Метод полімеразної ланцюгової реакції
Метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) заснований на багаторазовому копіюванні певної ділянки ДНК за допомогою ферменту – термостабільної ДНК-полімерази і специфічних праймерів в процесі повторюваних температурних циклів. Відбувається багаторазове збільшення кількості специфічних фрагментів ДНК збудника. Метод ПЛР має високу аналітичну чутливість та специфічність. Також перевагою є швидкість виконання досліджень.
Основні етапи ПЛР:
І. Виділення ДНК
Клінічний зразок обробляється лізуючого розчином в присутності частинок силики-сорбенту. В результаті відбувається вивільнення ДНК, яка зв’язується з частинками сорбенту. Інші компоненти лизированого клінічного матеріалу залишаються в розчині і видаляються при осадженні сорбенту центрифугуванням і подальшої відмиванням. При додаванні розчину для еллюціі ДНК до сорбенту відбувається перехід ДНК з поверхні силики в розчин, який відокремлюється від частинок сорбенту центрифугуванням. В результаті цієї процедури утворюється високоочищений преперат ДНК, вільний від інгібіторів реакції ампліфікації, що забезпечує високу аналітичну чутливість ПЛР дослідження.
Фото 1. Виділення ДНК з клінічного матеріалу
Фото 2. Виділення ДНК з клінічного матеріалу
ІІ. Ампліфікація ДНК
– процес багаторазового копіювання специфічної ділянки ДНК, обмеженого праймерами. Для проведення ампліфікації необхідна наявність в реакційної суміші ряду компонентів та прилад, який в короткі терміни з точністю може досягати і підтримувати певну температуру.
Склад реакційної суміші:
- ДНК-матриця, що містить ту ділянку ДНК, який потрібно ампліфікувати.
- Праймери- короткі синтетичні олігонуклеотиди, комплементарні протилежним кінцях різних ланцюгів необхідного фрагмента ДНК.
3.Термостабільная ДНК-полімераза – фермент, що каталізує реакцію полімеризації ДНК.
- Дезоксирибонуклеозидтрифосфати (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
- Буферний розчин, що забезпечує необхідні умови реакції.
Якщо в реакційній суміші присутня шукана ДНК, то відбувається ампліфікація специфічної ділянки ДНК, яка складається з:
- Денатурація,
- Отжиг,
- Єлонгація.
В процесі ампліфікації відбувається багаторазове збільшення кількості специфічних фрагментів ДНК. При цьому відбувається копіювання тільки тієї ділянки, яка задовольняє заданим умовам, і тільки в тому випадку, якщо він присутній в досліджуваному зразку.
Фото 3. Постановка реакції ампліфікаціїї в ПЛР-боксі
Фото 4. Програмування ампліфікатора
Фото 5. Постановка реакції у ампліфікатор
ІІІ Детекція
Детекцію проводять за допомогою спеціалізованого приладу – детектора ALA-1/4 та програмного забезпечення. Флуоріметр дозволяє реєструвати флуоресцентний сигнал зразків безпосередньо після проведення ПЛР через стінку пробірок, що зводить до мінімуму ризик контамінації лабораторії продуктами ПЛР.
Л.В. Носарева (біолог І категорії)
18.03.2019р.
Hits: 13949